陈松林
（中国水产科学研究院黄海水产研究所）

      2000年1月，本人从德国学习回国后调到黄海所工作，同年5月，黄海所成立了海水鱼类细胞、基因工程与分子育种实验室，主要从事海水鱼类种质（精子、胚胎）冷冻保存、胚胎干细胞培养和功能基因筛选与利用以及分子育种等方面的研究工作。7年来，本实验室从无到有、 从小到大，逐渐发展成为目前拥有6名固定工作人员（其中5名为博士）、 7～9名博士研究生、6～8名硕士研究生组成的20余人的研究团队。近几年来本团队共主持承担1项国家“973”项目课题、9项国家“863”项目、5项国家自然科学基金项目、1项农业部“948”项目、1项人事部留学回国人员基金、1项山东省农业良种重大项目子课题、 1项山东省自然科学基金项目、1项青岛市科技将才计划项目、1项青岛市科技攻关项目、1项中国水产科学研究院人才培养基金项目等各类研究课题15项，参加完成科技部种质资源平台建设和国家“863”国际合作项目等课题5项，主要涉及海水鱼类精子和胚胎冷冻保存、鱼类胚胎干细胞培养和基因打靶、海水鱼类抗病相关功能基因筛选与克隆、海水鱼类遗传多样性和分子标记等4个方面。2006年本研究团队申报的“水产种质资源与生物技术岗位”又被遴选为山东省“泰山学者”特聘教授岗位。现对近几年来的研究进展作一回顾，并对将来的发展前景进行展望。

一、 历史回顾

(一） 重要科研进展

1.养殖鱼类精子、胚胎冷冻保存和精子库建立与应用的研究

(1)在海水鱼类胚胎冷冻保存方面:在“863”课题的支持下，本人领导的研究团队以牙鲆和花鲈为材料，进行了胚胎玻璃化冷冻保存的研究。筛选出适宜海水鱼类胚胎的玻璃化液配方；确定了适宜玻璃化处理的胚胎发育时期，研制出特定的洗脱溶液，采用分步平衡、快速降温和解冻的技术路线，在国际上首次建立了海水鱼类胚胎玻璃化冷冻保存技术，并在牙鲆胚胎玻璃化冷冻保存上取得突破。共获得复活胚胎20粒，其中14枚冻胚孵化出鱼苗（Chen and Tian, 2005 Theriogenology, 63:1207~1219； 田永胜，陈松林等 2005 高技术通讯，2：81~86 ）。该项成果经专家鉴定达到国际领先水平。另外，还建立了牙鲆和鲈鱼胚胎程序化冷冻保存方法， 获得冷冻复活的牙鲆和鲈鱼胚胎。获得“鱼类胚胎玻璃化冷冻保存方法”的国家发明专利一项。

(2)在鱼类精子冷冻保存方面: 建立了鲈鱼、牙鲆、大菱鲆、大西洋牙鲆、漠斑牙鲆、半滑舌鳎、石鲽、圆斑星鲽、条斑星鲽和红鳍东方鲀等10多种海水养殖鱼类精子冷冻保存技术方法，进行了冻精解冻、授精实验。冷冻精液解冻后活率都在65%以上，冻精授精率高达80%以上，冻精授精鱼苗孵化率达75%以上，冻精受精能力与鲜精基本相同。进行了多次大批量授精实验。用230ml卵与1毫升冻精受精, 冻精授精率高达848%，孵化率为827%，最后孵化获得了 10多万尾冻精授精鱼苗。特别是用冷冻保存1年的鲈鱼和大菱鲆精子进行大批量授精，受精率高达80%以上，共获得冻精受精鲈鱼苗约20万尾， 获得冻精授精大菱鲆鱼苗约30万尾。充分表明，海水鱼类精液冷冻保存和解冻受精技术达到产业化应用水平，完全可以满足渔业生产应用的需要。同时，应用冷冻精液进行了杂交育种实验，获得了石鲽与牙鲆杂交的石-鲆鱼和大西洋牙鲆与牙鲆杂交获得的中-夏牙鲆。 应用我们的技术建立了首座海水养殖鱼类精子冷冻库，目前已经入库保存了鲈鱼、大菱鲆和牙鲆等10多种鱼类的精子共计2000多毫升。此外，应用微卫星标记技术证明冷冻精子受精后代与鲜精受精后代的遗传结构没有明显差别。 获得“鱼类精子冷冻保存的实用化方法”国家发明专利1项。

2.鱼类胚胎干细胞培养和基因打靶研究

      近5年来，本实验室通过主持承担人事部和教育部留学回国人员启动基金“海水养殖鱼类胚胎干细胞培养的研究”、国家自然科学基金“花鲈胚胎干细胞介导的基因转移技术研究”及国家863计划“海水养殖鱼类胚胎干细胞培养和基因打靶”等项目的研究工作，在海水鱼类胚胎干细胞培养和基因打靶等方面，取得如下重要进展：

（1）建立了外源基因高效转化青鳉胚胎干细胞的电穿孔技术；克隆了剑尾鱼酪氨酸受体激酶基因(Xmrk)的 65kb片段，构建了第一个鱼类同源重组载体并进行了基因打靶实验，表明正-负选择策略在鱼类细胞中的可行性，建立了鱼类细胞基因打靶的正-负选择技术。
（2）在国内率先开展了海水鱼类胚胎干细胞培养及基因打靶的研究工作。建立了花鲈和真鲷胚胎干细胞系，目前已分别传代至140多代和100多代。这些鱼类ES细胞具有在体外分化成黑色素细胞、神经细胞及肌肉细胞等不同类型细胞的能力。从真鲷和花鲈基因组DNA中分别克隆出48kb的肌肉生长抑制因子（myostatin）基因，测定了该基因的全部序列，构建了该基因的同源重组载体。
（3） 建立了将外源GFP基因转入花鲈胚胎干细胞的技术，转化效率达27%以上，建立了表达GFP基因的花鲈胚胎干细胞株，并在体外将这些GFP基因标记的胚胎干细胞诱导成神经细胞、肌肉细胞等不同类型细胞及拟胚体， 进一步证明了我们建立的鲈鱼胚胎干细胞系的发育多能性。
（4）通过细胞移植将表达GFP基因的干细胞移植到花鲈和斑马鱼囊胚中，分别获得了表达GFP的嵌合体胚胎，证明这些细胞具有体内分化潜力。
（5）建立了牙鲆、大菱鲆和漠斑牙鲆三种鱼的胚胎细胞系，目前已传至100和30多代，进行了病毒感染实验，表明牙鲆胚胎细胞系对海水鱼类囊肿病毒和虹彩病毒都很敏感，电镜观察表明这些病毒可以在胚胎细胞内增殖; 建立了鲈鱼脾脏、头肾和肝脏等5个组织细胞系。共建立了海水鱼类细胞系10个。

      该领域的研究成果共申报国家发明专利3项， 其中“鱼类胚胎细胞分离与培养方法”已获国家发明专利授权。

3.鱼类抗病相关功能基因筛选、克隆与表达的研究

      通过主持国家“973”项目课题“鱼类免疫相关功能基因研究”，“863”项目“牙鲆抗病相关因子的筛选与克隆”、国家自然科学基金项目“海水养殖鱼类抗菌肽基因克隆与重组表达”等课题的研究工作，在鱼类抗病相关功能基因筛选、克隆和表达等方面取得如下创新成果：

(1) 海水养殖鱼类抗菌肽基因克隆与表达： 构建了真鲷脾脏和头肾cDNA文库，测定了2000多个EST序列，获得了1100多个基因，筛选出150个功能基因，其中与鱼类免疫和抗病相关的功能基因达18个，已向GenBank 提交基因序列80余条。 从真鲷cDNA文库中筛选到具有自主知识产权的抗菌肽(hepcidin)基因,分析了该基因的结构及其组织表达特异性；克隆了大菱鲆和牙鲆的抗菌肽hepcidin基因，研究了该基因的时空表达规律，首次表明该基因的表达在胚胎发育中起着重要作用。构建了真鲷、牙鲆和大菱鲆hepcidin基因表达载体，并在酵母中表达生产了重组抗菌肽，细菌生长抑制实验表明重组抗菌肽对绿脓杆菌、嗜水气单胞菌及大肠杆菌具有明显的、剂量依存的抗菌活性。

(2)天然抗性相关巨嗜蛋白（Nramp）基因的克隆与表达分析： 克隆了真鲷和牙鲆天然抗性相关巨嗜蛋白基因及天然杀手增强因子等免疫相关功能基因。查明了这些鱼类Nramp基因的全长cDNA结构,并表明鳗弧菌感染能够明显升高肝脏和脾脏中的Nramp水平。

(3)重要海水养殖鱼类主要组织相容性复合体（MHC）基因的克隆与多态性分析： 近年来，采用文库筛选和同源克隆等技术克隆了真鲷、牙鲆和大菱鲆MHC II型基因,研究了真鲷MHC基因的分子多态性，发现真鲷至少具有7种MHC基因型，鳗弧菌感染导致肝、脾和头肾等组织中的MHC mRNA水平明显下降。同时，克隆了牙鲆和大菱鲆MHC基因，研究了这些鱼类MHC基因的分子多态性，发现这几种鱼类MHC基因存在广泛的多态性。

(4)牙鲆抗病群体的制备及抗病相关MHC基因标记的筛选： 通过自然选择和人工感染等途径，筛选到一批对病原菌具有明显抗性的牙鲆个体，共有200多条， 同时也获得了一批对病菌感染敏感的个体。比较了牙鲆抗病个体和不抗病个体MHC II型基因的分子多态性鉴定出13种不同的基因型，其中2个基因型（g和h）只在抗病个体中出现，而在不抗病个体中不出现，属于抗病相关的基因型，这种基因型可以作为候选抗病基因标记用于牙鲆抗病品种选育。

(5)大菱鲆抗病群体的获得及抗病相关基因筛选： 通过自然选择和人工感染获得了抗病和不抗病大菱鲆鱼，提取了部分抗病和不抗病鱼脾脏和头肾RNA，构建了cDNA文库， 测定了3000多个EST序列，获得了功能基因150多个， 其中与抗病/免疫相关的功能基因有30多个，主要包括抗菌肽、NRAMP、CXC趋化因子，CC趋化因子/趋化因子受体，C3补体，自然杀伤细胞增强因子(NKEF)，干扰素诱导蛋白，肿瘤坏死因子受体结合蛋白(TNFR)，白介素8(IL-8)受体，胸腺素β-12/β-4，主要组织相容性复合体(MHC) Class Ⅰ及ClassⅡ，转铁蛋白受体，免疫球蛋白D/MCC等， 150个功能基因序列全部被美国GenBank数据库收录。

4.海水养殖鱼类遗传多样性与抗病相关分子标记的研究

(1)通过文库构建和EST测序，从真鲷脾脏文库中筛选到微卫星序列80多条，并在GENEBANK登录，从中选出28个微卫星序列，进行引物设计和扩增，筛选出多态性微卫星引物11对。

 (2)开展了牙鲆分子标记技术的研究，建立了牙鲆微卫星分析技术，应用10对微卫星引物对中国牙鲆养殖群体进行了遗传结构的分析，表明经过人工多代繁殖和选育的牙鲆，其遗传多样性有所下降；同时， 建立了牙鲆遗传多样性分析的ISSR技术，分析了牙鲆养殖群体的遗传多样性变化。

（3）建立了牙鲆AFLP分析技术，应用61对AFLP引物组合扫描了牙鲆不抗病群体和抗病群体各20个个体，观察到有一些AFLP条带在两个群体中显示了极大的差异，初步筛选到抗病相关的候选AFLP标记2个。同时，还筛选到一些在不抗病群体中出现频率高的标记。目前正在进行该标记的克隆和序列分析。

(4)通过文库构建和EST测序，从大菱鲆脾脏文库中筛选到微卫星序列200多条，已在GENEBANK登录81条，目前正在进行这些微卫星的多态性分析。

（5）通过文库构建和规模测序方法，从半滑舌鳎中筛选到微卫星序列50多条， 并在GENEBANK登录，其中具有多态性的微卫星标记17个。

5.海水鱼类性别相关分子标记的筛选及性别控制技术的研究

     在“948”项目“鱼类遗传性别检测的分子生物学技术”、山东省农业良种产业化重大项目子课题“半滑舌鳎全雌育种技术的研究”、农业部海洋渔业资源可持续利用重点开放实验室开放课题“半滑舌鳎雌核发育及性别相关分子标记筛选”等课题的支持下，本实验室开展了半滑舌鳎性别相关AFLP分子标记筛选及性别控制的研究， 在国际上率先筛选到雌性相关AFLP分子标记7个，首次建立了半滑舌鳎遗传性别鉴定的PCR技术，为半滑舌鳎性别控制的研究及全雌苗种培育提供了技术手段。同时， 开展了半滑舌鳎人工雌核发育和性别控制的研究。

(二)成果鉴定和获奖

1.陈松林主持完成的“鱼类种质低温冷冻保存技术的建立与应用”成果获2006年度国家技术发明奖二等奖。
2.陈松林主持完成的“重要海水养殖鱼类精子和胚胎冷冻保存及种质冷冻库的建立与应用”成果于2004年6月通过了农业部组织的专家鉴定， 鉴定结果为国际领先水平。 该项成果获2005年度海洋创新成果二等奖。
3.陈松林主持完成的“半滑舌鳎性别特异分子标记的筛选及遗传性别鉴定技术的研究”成果于2006年10月通过了山东省科技厅组织的成果鉴定，并被鉴定为达到国际领先水平。

(三)论文发表情况

      2000年以来，本研究团队在国内外重要刊物上发表或即将发表论文近80篇，其中在国际重要刊物Antimicrob. Agents Chemo., Dev Comp Immunol., Gene, Theriogenology, Transgenic Research, Fish Shell Immunol， Dis. Aquat. Organ, Aquaculture ，J Fish Biol. 上发表SCI论文30多篇，总影响因子达55左右，平均影响因子达19左右; 另外还有4篇论文已被Fish Shell Immunol 和Mar Biotech等SCI刊物接受。

(四）专利申请情况

     近几年来， 本研究团队共申请国家发明专利12项， 其中3项已经获得国家发明专利授权。

(五） 人才培养情况

      近几年来本人共培养研究生30多人， 其中博士研究生10人， 硕士研究生20人，其中已毕业博士研究生5人， 硕士研究生12人。

二、前景与展望

     鱼类生物技术是当代渔业科学中最为活跃、发展也最为迅速的新领域之一。该项技术一方面为我们提供了在分子水平、细胞水平或个体水平对养殖鱼类进行定向设计、构建具有人们需要的具有特定优良性状的新物种或新品种的可能性；另一方面，应用该项技术，可以生产出防病、治病用或水产养殖用抗肿瘤药物、抗病疫苗或重组抗菌肽、多肽激素等生物活性物质。因此，这项技术已成为当今国际上水产和海洋领域中的前沿热点学科，也是21世纪水产科学的重点发展方向之一。

      针对我国水产养殖业中存在的重大问题，顺应国际水产生物技术领域的研究前沿和发展趋势，结合我国中长期发展规划中的研究内容和任务，面向建立创新型、国际一流研究所的宏伟目标，考虑到我所的现有基础和优势，现提出我所今后一个时期鱼类生物技术和种质资源领域的重点研究方向为：

(一)鱼类重要性状相关功能基因筛选、克隆与功能研究；
(二)鱼类抗病、抗逆和生长相关基因标记的筛选及基因标记辅助育种技术研究；
(三)鱼类胚胎干细胞培养和基因打靶技术的研究；
(四)鱼类性别控制及细胞工程育种技术的研究；
(五)鱼类重要性状相关分子标记的开发及分子标记辅助育种技术研究；
(六)鱼类胚胎冷冻保存技术研究；
(七)鱼类细胞库、精子库扩容及应用的研究； (八)渔用基因工程抗病药物和生物制品的研制。